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Jun 01, 2023

La capacidad de curación y el patrón de osteogénesis de la matriz de dentina desmineralizada (DDM)

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 13140 (2023) Citar este artículo 195 Accesos Detalles de métricas La matriz de dentina desmineralizada (DDM) es un material osteoconductor y osteoinductivo que tiene

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 13140 (2023) Citar este artículo

195 Accesos

Detalles de métricas

La matriz de dentina desmineralizada (DDM) es un material osteoconductor y osteoinductivo que se ha utilizado con éxito en el aumento del piso de los senos nasales y el aumento de la cresta alveolar en aplicaciones clínicas. Libera proteínas morfogenéticas óseas (BMP) y otros factores de crecimiento, lo que convierte al DDM en un material de injerto adecuado. Sin embargo, la partícula granular de DDM dificulta su anclaje en el área del defecto óseo. El objetivo de este estudio fue investigar los efectos biológicos y la osteoinductividad de la combinación de DDM y pegamento de fibrina (FG) en una proporción óptima sobre la curación ósea de un defecto óseo crítico en un modelo animal. La línea celular osteoblástica de ratón (MC3T3-E1) se cocultivó con diversas proporciones de DDM y FG para examinar sus efectos sobre la proliferación y diferenciación de osteoblastos, como lo indican la actividad de la fosfatasa alcalina (ALP), la producción de osteocalcina (OC) y la formación de nódulos mineralizados. . Luego se eligió la proporción óptima para un estudio adicional con un modelo defectuoso de calvario de conejo, en el que se implantaron compuestos DDM o DDM-FG1 (1 g: 0,1 ml) y DDM-FG2 (1 g: 0,5 ml), o se dejó en blanco. durante 2, 4, 8 y 12 semanas para investigar la regeneración de tejidos blandos y hueso nuevo. Se utilizaron análisis micro-CT y histológico para evaluar las propiedades totales del injerto según los diferentes períodos de curación. El resultado de estudios in vitro demostró que la proporción de 1:0,1 indujo más actividad de ALP y nódulos mineralizados, mientras que la proporción de 1:0,5 (DDM-FG combinado) indujo más osteocalcina (OC) en momentos específicos. En el modelo animal, el volumen de hueso nuevo 3D en todos los grupos de tratamiento con DDM-FG fue significativamente mayor que el del grupo en blanco a las 2, 4, 8 y 12 semanas. Además, el volumen de hueso nuevo fue mayor en DDM-FG2 en comparación con los otros grupos durante las primeras semanas del período de curación. En el análisis histológico, se formaron grupos de osteoblastos adyacentes a las partículas de DDM y se observó hueso recién formado en todos los grupos, lo que sugiere una propiedad osteoinductiva del DDM. Además, la mayor síntesis de colágeno nuevo observada a las 4 semanas sugirió que se indujo una curación ósea temprana en el grupo DDM-FG2. Este estudio demostró que, en una proporción óptima, el compuesto DDM-FG mejora las actividades osteogénicas y la regeneración ósea.

En el reciente aumento óseo se han aplicado varios tipos de materiales de injerto óseo. Entre estos materiales, el hueso autólogo demostrado, que demuestra conductibilidad, inductividad ósea y rendimiento de osteogénesis, se considera el estándar de oro del trasplante óseo1. Sin embargo, los injertos de hueso granular tienen las limitaciones de ser fácilmente dispersados ​​y esparcidos fuera del sitio implantado. Una solución es combinarlos con una membrana de barrera para lograr una función de mantenimiento del espacio. Sin embargo, las opciones alternativas son limitadas en términos de alto costo y aspectos éticos. Por lo tanto, estos inconvenientes han conducido al desarrollo de otros sustitutos óseos como materiales de injerto alternativos.

DDM es un tipo de dentina que se ha utilizado recientemente como material de injerto óseo. Se obtiene de dientes extraídos después de ser desmineralizados y esencialmente representa dentina desmineralizada2,3. Aunque la matriz de dentina y el hueso tienen estructuras diferentes, tienen composiciones químicas similares y pueden inducir la formación de hueso de manera tan consistente como la matriz ósea4. Tanto el hueso como la dentina son tejidos mineralizados compuestos por aproximadamente un 18% de colágeno (la mayoría de ellos es colágeno tipo I), un 2% de proteínas no colagenosas (NCP) y un 70% de hidroxiapatita (HA). La DDM puede liberar varios factores de crecimiento, como las proteínas morfogenéticas óseas (BMP), el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), el factor de crecimiento similar a la insulina (IGF), el factor de crecimiento transformante β (TGF-β) y el factor de crecimiento básico de fibroblastos ( FGF)5,6. Las BMP son los factores de crecimiento inductores de hueso más eficaces y pertenecen a la superfamilia TGF-β, que son citoquinas multifuncionales. Las BMP pueden inducir significativamente las diferentes etapas del proceso de curación ósea, como la fase inflamatoria, la angiogénesis, la formación de callos y la remodelación ósea7. VEGF mejora la angiogénesis mediante efectos inductores en las células endoteliales8. El TGF-β1 puede inducir la formación de hueso nuevo en un modelo animal con defectos óseos9 e induce de manera cooperativa la diferenciación osteogénica con las BMP10. Estos factores de crecimiento identificados desempeñan un papel crucial en la promoción de la migración celular a la región del defecto óseo, la proliferación y diferenciación para formar osteoblastos sintetizadores de hueso11, además de promover la angiogénesis.

El pegamento de fibrina (FG), también llamado sellador de fibrina, generalmente consta de dos componentes principales: fibrinógeno y trombina. La fibrina es una forma activada de fibrinógeno que es activada por la trombina, y el pegamento de fibrina activado tiene una cierta viscosidad, lo que favorece la coagulación sanguínea y el cierre de heridas12,13. La fibrina está compuesta de fibrinógenos unidos que desempeñan funciones importantes en la coagulación, la inflamación, la fibrinólisis, la remodelación de tejidos, las interacciones celulares y de la matriz y la cicatrización de heridas. En este estudio, combinamos el DDM granular y el pegamento de fibrina, lo que resultó en la conversión del material de injerto óseo granular en hueso gelatinoso y pegajoso, lo que ayudó en la integración del material de injerto óseo en partículas en el hueso alveolar y anclado al defecto óseo. superficie. El objetivo de este estudio fue investigar la proporción óptima de DDM y FG en el compuesto, para determinar el efecto de DDM-FG sobre la proliferación y diferenciación de células osteoblásticas de ratón. Además, los compuestos de DDM y DDM-FG se investigaron en un modelo animal de defectos óseos de la calvaria de conejos en los que se puede evaluar la capacidad de curación ósea y la osteogénesis.

El DDM molido se observó en color amarillo pálido (Fig. 1A1). Con un aumento de × 40 bajo SEM, las partículas de DDM parecían estar secas y sueltas (Fig. 1A2), mientras que se presentaron algunas capas de FG entre y sobre la superficie de las partículas de DDM en DDM-FG1 y DDM-FG2 (Fig. 1B2). ,1C2). Con un aumento de × 500, la mayoría de las aberturas de los túbulos dentinarios de las partículas de DDM generalmente se observaron y expusieron (Fig. 1A3). Con 0,1 ml de FG, el DDM se agrega, pero las partículas están sueltas en la Fig. 1B1; al mismo tiempo, el DDM-FG2 con 0,5 ml de FG mostró una apariencia pegajosa parecida a un hueso que se puede sujetar con pinzas en la Fig. 1C1. . DDM (Fig. 1A3), DDM-FG1 (Fig. 1B3) y DDM-FG2 (Fig. 1C3) mostraron aberturas tubulares de dentina obvias.

La aparición de DDM (A1 – A3), DDM-FG1 (B1 – B3) y DDM-FG2 (C1 – C3). (A2, B2 y C2 con barra de escala de 1000 μm; A3, B3 y C3 con barra de escala de 100 μm).

Después de 72 h de descalcificación, se encontró calcio en el sobrenadante a 5,19 mmol/L, el calcio liberado por DDM siguió aumentando después de 72 h. La liberación de calcio del DDM confirmó que el DDM que utilizamos en este presente estudio estaba parcialmente descalcificado (Fig. 2A).

(A) La cantidad de calcio liberado por la dentina humana después de la descalcificación. (B) La proliferación celular de células osteoblásticas MC3T3-E1 cocultivadas con diferentes DDM-FG en el sistema Transwell. (C, D) Una representación de la tinción con rojo de alizarina de nódulos minerales y los datos cuantitativos de los nódulos minerales formados después de cocultivar las células MC3T3-E1 con diferentes DDM-FG durante 14 y 21 días en el sistema Transwell (barra de escala de 100 µm). (E) La actividad de ALP después de que las células MC3T3-E1 se sembraran en DDM-FG durante 3 y 7 días. (F) La secreción de osteocalcina después de que las células MC3T3-E1 se cultivaran con diferentes materiales de injerto óseo durante 14 y 21 días en el sistema Transwell. Notas: Toda la significancia fue en P < 0,05*, P < 0,01** P < 0,001***. FG (0,1 ml), DDM-FG1 representa una proporción de 1 g de DDM con 0,1 ml de FG y DDM-FG2 representa una proporción de 1 g de DDM con 0,5 ml de FG.

El cultivo de MC3T3-E1 con diferentes materiales de injerto en el sistema Transwell reveló un crecimiento de MC3T3-E1 en todos los grupos en forma dependiente del tiempo. Para el día 7, DDM-FG1 indujo significativamente una mayor cantidad de proliferación celular que DDM-FG 2 y FG solos. El control en blanco es ligeramente superior pero no estadísticamente diferente al grupo DDM-FG1. Sin embargo, las proliferaciones celulares en el día 7 en el grupo de DDM, FG, DDM-FG1 y DDM-FG2 fueron menores en comparación con el control en blanco como se muestra en la Fig. 2B.

Después de que se cocultivaran diferentes compuestos DDM-FG con células MC3T3-E1 en un sistema Transwell. Los resultados de los nódulos visibles y la intensidad de la tinción de cada grupo se cuantificaron en la Fig. 2C,D. El día 14 y el día 21, se observaron nódulos mineralizados de diferentes tamaños en el grupo DDM, el grupo DDM-FG1, el grupo DDM-FG2 y el grupo FG, presentándose en color rojo. Hubo más cantidad y tamaño de nódulos mineralizados tanto en DDM-FG1 como en DDM-FG2 en comparación con el grupo DDM. Los nódulos mineralizados se formaron principalmente en el grupo DDM-FG1 (P <0,01), que es mayor que otros grupos. Solo hay unos pocos nódulos mineralizados en el grupo FG que son similares al grupo de control en blanco.

La actividad de ALP de MC3T3-E1 cultivada en medio osteogénico con DDM, DDM-FG1 y DDM-FG2 fue significativamente mayor en comparación con el MC3T3-E1 solo en los días 3 y 7, como se muestra en la Fig. 2E. Se demostró que la combinación de DDM con FG induce significativamente más actividad de ALP en comparación con la DDM sola. Además, la actividad de ALP se detectó en el nivel más alto en el grupo DDM-FG1. FG no alteró la actividad de ALP en el día 3 o el día 7.

La secreción de osteocalcina detectada en los días 14 y 21 fue significativamente mayor en los grupos DDM, DDM-FG1 y DDM-FG2 que los grupos control y FG (Fig. 2F). El nivel más alto de secreción de osteocalcina se encontró en DDM-FG2 el día 14 y significativamente mayor que en DDM y DDM-FG1 el día 21 (P <0,001).

Las imágenes de reconstrucción por Micro-CT (Fig. 3A) mostraron que hubo nueva formación de hueso entre 2 y 12 semanas, sin embargo, no se curó completamente el área defectuosa del hueso en el grupo en blanco. El hueso nuevo comenzó a formarse en el borde del defecto óseo, que se caracterizaba por ser un hueso tejido fino e irregular. Para el grupo DDM, las partículas de DDM parecen sueltas y se encontraron múltiples espacios pequeños en el área regenerativa, especialmente en la etapa inicial de la fase de curación ósea, es decir, 2 semanas o 4 semanas (Fig. 3A). Mientras tanto, las partículas de DDM estaban bien adheridas en el grupo DDM-FG1 y DDM-FG2.

(A) Las imágenes de reconstrucción en 3D de los defectos óseos después de que se implantaran DDM, DDM-FG1 y DDM-FG2 durante 2, 4, 8 y 12 semanas. (B) El parámetro BV/TV y (C) la densidad mineral ósea del análisis del parámetro de defectos óseos. Notas: Toda la significancia fue en P < 0,05*, P < 0,01** P < 0,001***. DDM-FG1 representa una proporción de 1 g de DDM con 0,1 ml de FG y DDM-FG2 representa una proporción de 1 g de DDM con 0,5 ml de FG.

El aumento de BV/TV se detectó significativamente en los grupos DDM, DDM-FG1 y DDM-FG2 a las 4 semanas en comparación con el grupo de control en blanco (P <0,05) (Fig. 3B). El BV/TV mostró una tendencia de aumento de la siguiente manera: control en blanco

En el grupo en blanco, no hubo evidencia de formación de tejido duro en el área defectuosa hasta las 4 semanas, cuando se detectó tejido fino teñido con minerales en el margen del defecto óseo (Fig. 4A). A las 8 y 12 semanas, creció visiblemente nuevo hueso tejido desde el margen hacia el centro, y el hueso más grueso se formó con la cubierta de periostio. Sin embargo, las conexiones de tejido no se completaron por completo en el grupo en blanco. La distribución de partículas de DDM estaba dispersa en el grupo de DDM y las partículas no podían permanecer en la posición de implantación. En DDM-FG1 y DDM-FG2, las partículas de DDM se distribuyeron uniformemente en el defecto con una superficie relativamente más suave en comparación con el grupo de DDM. A mayor aumento, se encontró que la presencia de túbulos dentinarios se reabsorbía gradualmente en todos los grupos de DDM después de 4 semanas. Se observó la formación de hueso nuevo circundante, con muchos osteocitos localizados en las lagunas óseas (Fig. 4B). Parecían tener más hueso recién formado en el grupo DDM-FG2 en comparación con el grupo DDM y DDM-FG1 después de 12 semanas de implantación.

(A) La tinción H&E representativa de los defectos óseos que se implantaron con diferentes compuestos de DDM a las 2, 4, 8 y 12 semanas; la barra de escala = 1000 μm; (B) Las partículas de DDM fueron reabsorbidas y rodeadas de osteoide. Se encontró la nueva formación ósea; la barra de escala = 100 μm. (NB: hueso nuevo, flecha: los osteoblastos adyacentes, OD: osteoide).

Los hallazgos histológicos de las secciones teñidas con Masson son similares a las secciones teñidas con HE (Fig. 5A), y había abundantes vasos sanguíneos recién formados y fibras de colágeno óseo I en el sitio de implantación de DDM-FG1 y DDM-FG2 (Fig. 5B). El área de colágeno I de todos los grupos aumentó con el tiempo. Fue significativamente mayor en los grupos DDM, DDM-FG1 y DDM-FG2 que en el grupo en blanco de 2 a 8 semanas (P <0,001) (Fig. 5C). El área promedio de colágeno nuevo en el grupo DDM-FG2 se indujo significativamente temprano a las 4 y 8 semanas en comparación con el grupo DDM (P <0,01). A las 8 semanas, la formación de colágeno en el grupo DDM-FG2 fue significativamente mayor que la del DDM-FG1 (P <0,05).

(A) Hallazgos histológicos de secciones teñidas con Masson (la barra de escala = 1000 μm); (B) Hubo más vasos sanguíneos nuevos y Col-I en los grupos DDM-FG en comparación con el grupo DDM a las 2, 4, 8 y 12 semanas, la barra de escala = 100 μm) (NB: hueso nuevo, OD: osteoide , asterisco: vasos sanguíneos ). (C) Los datos cuantitativos del área de colágeno I de los defectos óseos a las 2, 4, 8 y 12 semanas. Notas: Toda la significancia fue en P < 0,05*, P < 0,01** P < 0,001***. DDM-FG1 representa una proporción de 1 g de DDM con 0,1 ml de FG y DDM-FG2 representa una proporción de 1 g de DDM con 0,5 ml de FG.

La utilización de sustitutos y materiales de injertos óseos en odontología ha aumentado significativamente en los últimos años debido a los avances en implantes dentales y la creciente demanda de recuperación de diversos tipos de defectos óseos. La Matriz de Dentina Desmineralizada (DDM), obtenida a partir de dientes extraídos, ha sido utilizada como material de injerto óseo en cirugías de aumento óseo debido a sus propiedades osteoinductivas y osteoconductoras, como lo confirman varios estudios14,15. Además, los experimentos con animales han demostrado que la DDM es biocompatible y osteoinductiva, comparable a la matriz ósea descalcificada (DBM)16. El pegamento de fibrina (FG) es un material biopolimérico que se presenta por tener una excelente biocompatibilidad, una tasa de degradación controlable y la capacidad de mejorar la adhesión celular y mejorar la angiogénesis. El material se puede administrar en forma líquida en sitios de forma irregular, lo que aumenta su utilidad quirúrgica17. Dadas las características biológicas de las partículas de DDM y FG, y la necesidad de un material de injerto alternativo adecuado, el presente estudio tuvo como objetivo investigar la condición óptima de la combinación de DDM y FG para la osteogénesis y la regeneración ósea en un modelo de defecto calvarial en conejo.

Las diferencias morfológicas entre DDM, DDM-FG1 y DDM-FG2 revelaron que las características físicas de las partículas de DDM mejoraron claramente al aumentar la proporción de FG. La proporción óptima de FG mantuvo la estructura naturalmente porosa del DDM. En un estudio previo sobre la implantación del DDM en un defecto óseo de la calvaria durante 12 semanas, la investigación ultraestructural de la interfaz entre el DDM y el hueso nuevo circundante ilustró una conexión en red de los procesos celulares de los osteocitos en el tejido óseo nuevo con el DDM. , que se extendía hasta los túbulos dentinarios. Esta evidencia sólida indicó que la presencia de túbulos dentinarios proporciona más áreas para la unión celular, facilita el intercambio de sustancias y promueve el crecimiento de vasos sanguíneos en el material profundo18. En este estudio, observamos aberturas de los túbulos dentinarios en nuestros DDM, DDM-FG1 y DDM-FG2 de fabricación propia después de una desmineralización parcial efectiva. Se ha informado que el efecto biológico de la FG mejora la diferenciación de osteoblastos (MC3T3-E1) y la proliferación celular después del cocultivo directo con fibrina19. Además, en una siembra directa en osteoblastos, la concentración de trombina cambió la estructura de la fibrina de manera dependiente de la dosis, proporcionando un microambiente adecuado para la unión y diferenciación de los osteoblastos, como lo confirma el nivel de deposición de calcio, la actividad de ALP y el nivel de Runx220. A diferencia de informes anteriores, la FG por sí sola no pudo inducir eficazmente la proliferación y diferenciación de los osteoblastos en comparación con la DDM o la DDM-FG en el presente estudio. Mientras tanto, la combinación de 0,1 y 0,5 ml de FG con DDM mejoró aún más la diferenciación celular al inducir una mayor actividad de ALP, más nódulos de calcio y osteocalcina. Es posible que en el sistema Transwell de nuestro experimento, las células estuvieran expuestas indirectamente a FG y otros materiales, lo que llevaría a una respuesta biológica diferente a la observada con capacidad de unión celular directa.

En un modelo animal, la combinación de cemento de fosfato cálcico (CPC) con FG se implantó en defectos óseos de conejo con proporciones variadas. Las imágenes de reconstrucción 3D demostraron que la proporción 1:1 produjo la mayor formación ósea21,22. El número de secciones vasculares indicó que: la proporción 1:1 fue mayoritariamente eficaz para estimular una angiogénesis. Por lo tanto, la combinación de material granular y FG en una proporción de 1:1 (g/ml) pareció demostrar una regeneración ósea y angiogénesis significativas. Sin embargo, a diferencia de un estudio previo en animales, nuestro estudio no encontró buenas respuestas celulares cuando se usó una proporción 1:1 de DDM (mg) y FG (ml), mientras que otras proporciones (1:0,1 y 1:0,5) sí dieron como resultado buenas respuestas celulares. Además, los 0,1 y 0,5 ml adicionales de FG a DDM demostraron efectos suplementarios sobre la diferenciación de osteoblastos y promovieron la regeneración ósea y la angiogénesis cuando se implantaron en los defectos óseos de la calvaria del conejo. Es posible que cantidades excesivas de FG no siempre complementen las propiedades biológicas de buenos materiales de injerto, ya que pueden bloquear completamente los túbulos dentinarios y provocar la pérdida de la estructura porosa del DDM, interfiriendo así con las respuestas celulares y la regeneración ósea.

La creación de espacios estables y el mantenimiento son factores cruciales que podrían determinar el éxito de la regeneración ósea23. El tamaño óptimo de las partículas es esencial para garantizar una tasa de resorción adecuada durante la reconstrucción ósea y al mismo tiempo mantener el volumen del defecto para el crecimiento interno de hueso nuevo24. El tamaño de partícula de nuestro DDM de fabricación propia fue de 400 a 1000 μm, lo que proporcionó una buena regeneración ósea en el defecto óseo, similar a otros estudios previos25,26. Entre otras proteínas de andamio, se demostró que la FG es un buen portador para la liberación de BMP-2 y podría prolongar el tiempo de liberación de BMP-227,28. Mientras tanto, se sabe que BMP-2 se produce y secreta lentamente a partir de DDM; con la presencia de FG, crearía un entorno adecuado para la osteogénesis y la curación ósea en nuestros grupos de DDM-FG que el DDM solo.

En conclusión, tanto DDM-FG1 como DDM-FG2 demostraron una buena biocompatibilidad y se descubrió que promueven la regeneración ósea al mejorar la diferenciación osteogénica, mejorar el microambiente osteogénico y aumentar la capilarización en el área del defecto óseo. Estos compuestos eran más prácticos debido a sus mejores propiedades físicas y su menor tasa de degradación en el hueso huésped. Por lo tanto, basándose en la proporción óptima de DDM-FG combinados, mejoró las actividades osteogénicas y la regeneración ósea además de la DDM, como lo confirman los resultados in vitro e in vivo. Este estudio proporciona nuevos conocimientos sobre una combinación de materiales de injerto que pueden potenciar el DDM como un biomaterial eficaz para la cirugía bucal.

En este experimento, la fuente de la dentina preparada para el DDM proviene de molares, premolares o dientes impactados no cariados de pacientes que acudieron a someterse a una extracción dental en el departamento de cirugía oral y maxilofacial de la facultad de odontología de la Universidad Mahidol. Aunque la recolección de muestras no retuvo ninguna información de identificación, se obtuvo el consentimiento informado de todos los sujetos y/o sus tutores legales. Todos los métodos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices y regulaciones pertinentes aprobadas por el comité de ética de la Facultad de Odontología/Facultad de Farmacia de la Universidad Mahidol, Junta de Revisión Institucional (MU-DT/PY-IRB 2020/029.1007).

El DDM se produjo utilizando un método modificado29. Brevemente, se usó solución salina normal (NS) fría para lavar el diente extraído y se usó un taladro dental de alta velocidad para eliminar por completo el tejido blando, el cemento y el esmalte (Fig. 6A). Luego, el resto del tejido de dentina y pulpa se trituraron en partículas pequeñas (el tamaño de partícula es de 400 a 1000 μm) (Fig. 6B), se pusieron en alcohol etílico/éter dietílico durante 4 horas a 4 °C para desengrasarlos y luego se lavaron dos veces con agua desionizada. En la etapa de desmineralización, se usó HCl 0,6 mol/L durante 72 h a 4 °C, luego se lavaron repetidamente las partículas con un vibrador ultrasónico. Por último, el DDM liofilizado se envasó y esterilizó con radiación de cobalto-60 de 25 kGy durante 12 h y se almacenó a -20 °C.

(A) Se extrajo el diente extraído con esmalte, cemento y tejidos blandos; (B) Las partículas de DDM molidas con un tamaño de 400 a 1000 μm; (C) El FG recién preparado y (D) el FG completamente gelatinizado. (E) El sistema de cultivo Transwell utilizado en los experimentos de proliferación celular, nódulos minerales y secreción de osteocalcina.

En este experimento se utilizó el kit de sellador de fibrina porcina (Guangzhou Beixiu, China) (Fig. 6C, D). Los componentes principales de la FG son el fibrinógeno (30,0 mg/ml) y la trombina (650 UI/ml). El fibrinógeno y la trombina son los principales componentes activos del pegamento de fibrina, que se preparan a partir de plasma porcino sano, que ha sido separado, purificado e inactivado por el virus.

La liberación de Ca2+ se detectó utilizando un kit de detección de calcio (Instituto de Bioingeniería Nanjing Jiancheng) para confirmar el grado de descalcificación del DDM de 1 a 96 h.

Las partículas de DDM y los compuestos mixtos de DDM-FG se observaron mediante un microscopio electrónico de barrido (SEM) (Hitachi SU8220 Japón). Después de la liofilización, las muestras se fijaron con glutaraldehído al 2,5% durante 24 h. Después de lavar 3 veces con PBS, se realizó una deshidratación en gradiente de etanol y un secado al aire. Las muestras se recubrieron con pulverización de oro y se observaron morfológicamente bajo un SEM a 12 kV.

Doce horas después de la siembra, se cultivaron MC3T3-E1 en medio basal: medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con suero bovino fetal al 10% y solución de estreptomicina al 1% con una temperatura de 37 °C, CO2 al 5% y una humedad de 70 a 80ºC. %. El medio se reemplazó cada tres días. El sistema de cocultivo se realizó en transwell (con un tamaño de poro de 8 μm) para los experimentos de osteocalcina y nódulo de calcio de proliferación celular, como se muestra en la Fig. 6E.

Se utilizó un kit de recuento celular-8 (CCK-8, Dalian Meliun Biotechnology, China) para evaluar cuantitativamente la proliferación de células MC3T3-E1. Después de que se cultivaron 500 μl de suspensión celular con una densidad de 1 × 104 en el sistema Transwell () en la cámara inferior de una placa de 24 pocillos durante 4 h, los diferentes DDM-FG (DDM-FG1 representan la proporción de 1 g de DDM con 0,1 ml de FG y DDM-FG2 que representa la proporción de 1 g de DDM con 0,5 ml de FG) se colocaron en la cámara superior. Luego, después de 1, 3, 5 y 7 días, el medio de cultivo original se reemplazó por 500 µl de DMEM con 10 % de FBS que contenía 50 µl de reactivo CCK-8. Después de incubar a 37 °C durante 4 h, se tomaron 100 µl de la solución anterior de cada muestra y se agregaron a una placa de 96 pocillos. Se prepararon tres réplicas paralelas. La absorbancia a 450 nm se determinó utilizando un lector de microplacas (Muliskan, Thermo, EE. UU.). La prueba se repitió de forma independiente tres veces.

Para investigar la actividad de ALP ósea, se utilizó un kit de ensayo de fosfatasa alcalina (Biyuntian Biotechnology, China). La osteogénesis fue inducida por el medio de diferenciación osteogénica (Oricell Therapeutics, China) que contenía medio basal mezclado con ácido ascórbico 200 μM, β-glicerofosfato 10 mM y dexametasona 100 nM. Diferentes compuestos DDM-FG; Se prepararon DDM-FG1, que representa una proporción de 1 g de DDM con 0,1 ml de FG, y DDM-FG2, que representa una proporción de 1 g de DDM con 0,5 ml de FG, y se colocaron en placas de 6 pocillos hasta que FG estuvo completamente gelatinizado. Se inocularon células MC3T3-E1 con una densidad de 1 × 104/ml en la superficie de diferentes compuestos DDM-FG directamente y se cultivaron en una incubadora a 37 °C. A los 3 y 7 días, el tampón de lisis celular se centrifugó a 1200 rpm/min a 4 °C durante 25 minutos y el sobrenadante se tomó para analizar. Después de agregar 100 µl de solución de terminación de la reacción a cada pocillo, se midió la absorbancia a 405 nm con un lector de microplacas (Muliskan, Thermo, EE. UU.). La cantidad de ALP necesaria para la hidrólisis del fosfato de paranitrofenilo para producir 1 μmol de p-nitrofenol por minuto se definió como una unidad de actividad enzimática y se calculó la actividad de la fosfatasa alcalina. La prueba se repitió de forma independiente tres veces.

Se inocularon 2 x 104/ml de células MC3T3-E1 en la cámara inferior de Transwell en una placa de 6 pocillos, diferentes compuestos DDM-FG (DDM-FG1, 1 g de DDM con 0,1 ml de FG, DDM-FG2, 1 g de DDM con 0,5 ml FG) se prepararon en la cámara superior de Transwell y se cultivaron en una incubadora a 37 ° C (como se muestra en la Fig. 6E). A los 14 y 21 días, se descartaron los diferentes materiales en la cámara superior, las células de la cámara inferior se tiñeron con rojo de alizarina al 0,1% durante 5 minutos siguiendo las instrucciones del kit de tinción con rojo de alizarina (Beyotime Biotechnology, China). Después de tomar fotografías de los nódulos, se añadió acetilpiridina al 10% a la placa de 6 pocillos, 500 µl/pocillo, y se incubó la solución a 37 °C durante 15 minutos para disolver los nódulos mineralizados. Por último, las soluciones incubadas se midieron a 570 nm de absorbancia con el lector de microplacas (Muliskan, Thermo, EE. UU.). La prueba se repitió de forma independiente tres veces.

Se inocularon 2 x 104 / ml de células MC3T3-E1 en la cámara inferior del transwell, mientras que se colocaron diferentes proporciones de compuestos DDM-FG en la cámara superior y se cultivaron en el medio inductor osteogénico. A los 14 y 21 días se desecharon los diferentes materiales de la cámara superior, se recogió el medio de cultivo y se centrifugó a 1000 rpm/min durante 20 min. El sobrenadante se tomó para el ensayo de osteocalcina utilizando un kit ELISA (Elabscience Biotechnology, China). Se midió inmediatamente la intensidad de la solución (λ = 450 nm).

El protocolo de estudio con animales ha sido aprobado por el Comité Ético de Experimentos con Animales de la Universidad Médica de Kunming, Kunming, provincia de Yunnan, China (kmmu2018029). Todos los métodos se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas y regulaciones pertinentes, que se informan de acuerdo con las pautas de ARRIVE. Para este estudio, se eligieron cuarenta conejos japoneses machos adultos de orejas grandes, de 12 ± 3 meses de edad y peso de 3,5 ± 0,3 kg30. Los conejos fueron monitoreados diariamente durante todo el período del estudio por un veterinario acreditado. Durante este experimento, los conejos fueron alimentados con comida y agua ad libitum. Después de un período de aclimatación de 4 semanas, el tratamiento fue aleatorizado por un ejecutante ciego que no realizó ni investigó el resultado, por lo que fue "ciego" al estudio.

La anestesia general se indujo con una inyección intramuscular de 0,15 ml/kg de clorhidrato de xilacina31 (productos de salud animal Jilin huamu, China). Dos cirujanos experimentados realizaron todos los procedimientos quirúrgicos en 30 minutos, siguiendo los pasos de la Fig. 7. Brevemente, se extirparon los tejidos blandos y el periostio calvarial (Fig. 7A). Se utilizó una fresa trefina de 6 mm de diámetro para crear 4 defectos óseos (Fig. 7B). Se prepararon blanco, DDM, DDM-FG1 (1 g de DDM con 0,1 ml de FG) y DDM-FG2 (1 g de DDM con 0,5 ml de FG) (Fig. 7C) y se implantaron aleatoriamente en áreas de defectos óseos (Fig. 7D). Se mezclaron una suspensión de ibuprofeno de 1 ml/día y una solución de amoxicilina-clavulanato de potasio de 75 mg/día con la comida de los conejos durante 3 días después de la cirugía. Cada conejo se alojó en jaulas separadas en condiciones estándar de laboratorio a una temperatura promedio de 21 °C. Todos los conejos sobrevivieron después de la cirugía y estuvieron sanos hasta la eutanasia.

La preparación de los defectos óseos de la calvaria de los conejos y los reemplazos designados del material de injerto.

Cada diez conejos fueron sacrificados mediante una sobredosis de ketamina32 a las 2, 4, 8 y 12 semanas. Los cráneos que contenían el área del defecto quirúrgico se cortaron y se sometieron a preparación de muestras para exploración µCT y análisis histológico.

Las muestras de hueso se empaparon en formaldehído neutro al 4% y se almacenaron a 20 °C. Las muestras se escanearon utilizando un escáner Micro-CT (SCANCO, Suiza) con una resolución de escaneo de 11,4 μm, voltaje (70 kVp), corriente (114 μA) en un ángulo de rotación estándar de 360° durante 150 min. Después del escaneo, los datos se reconstruyeron (software de procesamiento de imágenes μCT Ray V4.2) y se realizó un análisis cuantitativo de todos los parámetros óseos utilizando el software μCT Assessment Program V6.6 para examinar el crecimiento de hueso nuevo en diferentes fases.

Se utilizó una solución de formalina tamponada neutra al 4% para fijar las muestras y luego se almacenó en etanol al 70% a 4 °C antes del procesamiento histológico. La calvaria de los conejos se empapó en Rapid Cal. Immuno™ (BBC Biochemical, USA), pH < 1, durante unos 6 días hasta su descalcificación total. Luego, las muestras se enjuagaron durante 10 minutos con agua corriente, se deshidrataron con alcohol de graduación ascendente, se aclararon con xileno y se incluyeron en parafina. Se cortaron secciones seriadas de 5 μm de espesor desde el centro del defecto óseo original. Las secciones de parafina se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E) y colorantes tricrómicos de Masson y luego se observaron bajo microscopio estereoscópico (Nikon SMZ 745 T, Japón) y microscopía óptica (AXIO Lab.A1, ZEISS, alemán) para investigar la curación ósea y el tipo de colágeno. Hago declaración, respectivamente. Luego, las imágenes se capturaron utilizando el software NIS-Elements F 4.60.00 de 64 bits y ZEN 3.0 (edición azul). Para cuantificar el área de colágeno en las secciones de Masson, el software Image-Pro Plus 6.0 calculó las 3 áreas de ciertos cuadrados ubicados en el campo central de cada portaobjetos.

Todos los datos se presentaron como media ± desviación estándar \((\overline{x} \pm s \cdot d)\). Se utilizó ANOVA para el análisis estadístico y la prueba HSD de Tukey para la comparación individual. El software estadístico utilizado en este experimento es el software estadístico Statistical Package for Social Sciences (IBM SPSS Statistics, EE. UU.). El nivel de significación estadística se fijó en un valor de p < 0,05.

La aprobación ética animal para este estudio se obtuvo del Comité de Ética de la Universidad médica de Kunming (kmmu2018029). La aprobación ética del estudio en humanos fue otorgada por la Facultad de Odontología/Facultad de Farmacia de la Universidad Mahidol, Junta de Revisión Institucional, Tailandia (No. MU-DT/PY-IRB 2020/029.1007).

Los conjuntos de datos utilizados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente (DS) previa solicitud razonable.

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Este proyecto de investigación cuenta con el apoyo de la Universidad Mahidol (Fondo Fundamental: año fiscal 2023 del Fondo Nacional de Investigación e Innovación Científica (NSRF), Colaboración Dental Internacional de la Región del Río Mekong (IDCMR), Proyecto General Conjunto de la Universidad Médica de Kunming (subvención n.° 202101AY070001 -194), importante proyecto conjunto de la Universidad de Medicina de Kunming (subvención n.° 202101AY070001-025), la subvención innovadora para estudiantes universitarios (subvención n.° 2021JXD178) y el programa de ciencia y tecnología de Sichuan (2021YFH0015). También agradecemos a Zichao Dai, Rongqiang Yang. , Ying Huang, Rui Chen, Hengli Tong y Xiaomei Li por su asistencia técnica, y el Prof. Dr. Nisarat Ruangsawasdi, el Prof. Dr. Kajohnkiart, el Prof. Natthamet Wongsirichat, el Prof. Dr. Panjit Chunhabundit, el Prof. Dr. Panjit Chunhabundit. Prof. Dr. Ratchapin Laovanitch Srisatjaluk por sus consejos.

Departamento de Biología Oral, Facultad de Odontología, Universidad Mahidol, 6 Yothi Street, Ratchathewi, Bangkok, Tailandia

Jibo Bao y Dutmanee Seriwatanachai

Departamento de Implantología, Escuela y Hospital de Estomatología, Universidad Médica de Kunming, Comunidad Internacional Hecheng, Edificio C, No.1088 en medio de Hai Yuan Road, Distrito de Wuhua, Kunming, Yunnan, República Popular China

Jibo Bao y Zhigang Xie

Laboratorio clave de estomatología de Yunnan, Kunming, Yunnan, República Popular China

Jibo Bao y Zhigang Xie

Departamento de Clínica Dental Chenggong, Escuela y Hospital de Estomatología, Nuevo Distrito Chenggong, Universidad Médica de Kunming, Ciudad Universitaria, Calle Yuhua, Kunming, Yunnan, República Popular China

Xunan Fu

Departamento de la Segunda Clínica Dental, Escuela y Hospital de Estomatología, Universidad Médica de Kunming, Calle Yuantong, Distrito de Wuhua, Kunming, Yunnan, República Popular China

Yirong Wu

Departamento de la Primera Clínica Dental, Escuela y Hospital de Estomatología, Universidad Médica de Kunming, Calle Hongyun, Distrito de Wuhua, Kunming, Yunnan, República Popular China

Shengyin Yang

Departamento de Periodoncia, Escuela y Hospital de Estomatología, Universidad Médica de Kunming, Comunidad Internacional Hecheng, Edificio C, Distrito de Wuhua, Kunming, Yunnan, República Popular China

Xiaobin Ren

Facultad de Estomatología, Universidad Médica de Kunming, distrito de Chenggong, Chunrong West Road, Kunming, Yunnan, República Popular China

Colmillo Xingchen

Laboratorio Estatal Clave de Enfermedades Bucales, Centro Nacional de Investigación Clínica de Enfermedades Bucales, Hospital de Estomatología de China Occidental, Universidad de Sichuan, Chengdu, República Popular de China

Quan Yuan

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BJ: Curación de datos; análisis formal; metodología; software; validación; visualización; escritura—borrador original. XF: Metodología; software. YW: Metodología; software. SY: Metodología; validación; visualización. XR: Metodología; validación; visualización. XF: Metodología; software. QY: Conceptualización; análisis formal; adquisición de financiación; metodología; administración de proyecto; visualización; Escritura: revisión y edición. ZX: Conceptualización; análisis formal; adquisición de financiación; administración de proyecto; visualización. DS: Conceptualización; curación de datos; análisis formal; adquisición de financiación; metodología; administración de proyecto; recursos; supervisión; visualización; Escritura: revisión y edición. Todos los autores revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Zhigang Xie o Dutmanee Seriwatanachai.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Bao, J., Fu, X., Wu, Y. et al. La capacidad de curación y el patrón de osteogénesis del compuesto de pegamento de fibrina (FG) de matriz de dentina desmineralizada (DDM). Representante científico 13, 13140 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-40258-7

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Recibido: 31 de marzo de 2023

Aceptado: 07 de agosto de 2023

Publicado: 12 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-40258-7

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